1月27日，清華大學(xué)化工系生物育種技術(shù)與裝備團(tuán)隊(duì)在《核酸研究》（Nucleic Acids Research）發(fā)表文章，采用高通量手段系統(tǒng)研究了sgRNA與靶標(biāo)DNA錯(cuò)配效應(yīng)對dCas9結(jié)合活性的影響。

近年來，作為可編程的DNA靶向工具，CRISPR/(d)Cas系統(tǒng)在基因編輯、高通量遺傳篩選、染色體成像、合成基因路線構(gòu)建、新型抗菌藥物和體外核酸檢測等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。對于每個(gè)應(yīng)用而言，向?qū)NA（sgRNA）與靶標(biāo)DNA之間的序列同源性對CRISPR/(d)Cas系統(tǒng)活性的影響都是至關(guān)重要的。為加深對這個(gè)問題的理解，作者在大腸桿菌中構(gòu)建了兩個(gè)覆蓋所有單核苷酸和雙核苷酸突變的sgRNA文庫，并利用高通量的方法在活細(xì)胞內(nèi)解析了文庫中每個(gè)sgRNA介導(dǎo)dCas9與靶標(biāo)DNA結(jié)合的親和力。

圖1 高通量解析不同錯(cuò)配sgRNA對dCas9與靶標(biāo)結(jié)合活性的影響

該研究基于高通量實(shí)驗(yàn)手段發(fā)現(xiàn)種子區(qū)域（PAM近鄰7-12 bp）的錯(cuò)配對結(jié)合活性的影響較大，而PAM遠(yuǎn)端區(qū)域可以容忍多個(gè)錯(cuò)配；種子區(qū)的錯(cuò)配存在協(xié)同效應(yīng)，即兩個(gè)錯(cuò)配的組合對結(jié)合活性的影響大于兩個(gè)對應(yīng)單獨(dú)錯(cuò)配影響的加和。特別的，相對于其它錯(cuò)配類型，dDrG（D = A, T, G）對dCas9結(jié)合的影響相對溫和，與核酸熱力學(xué)數(shù)據(jù)呈現(xiàn)出一致性，并得到了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖2 錯(cuò)配sgRNA介導(dǎo)的CRISPR/dCas9結(jié)合活性的系統(tǒng)解析

CRISPR/(d)Cas9識(shí)別并結(jié)合靶標(biāo)主要分為兩個(gè)步驟，首先是PAM （NGG）的識(shí)別及其近鄰堿基的熔化，接著是鏈侵入過程，即sgRNA與熔化的靶標(biāo)DNA發(fā)生退火，并延伸至PAM遠(yuǎn)端?；贑RISPR/(d)Cas9的結(jié)合機(jī)理和實(shí)驗(yàn)觀測，論文將鏈侵入過程的狀態(tài)轉(zhuǎn)移視作馬爾可夫鏈，并使用文獻(xiàn)報(bào)道的核酸熱力學(xué)數(shù)據(jù)計(jì)算每個(gè)狀態(tài)的概率，最終發(fā)現(xiàn)dCas9的解離概率與結(jié)合親和力存在較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)關(guān)系，并能很好的與文獻(xiàn)報(bào)道的體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)吻合。該模型也能外推至更多錯(cuò)配的情形，一定程度上證明了其普適性，對于深入理解和應(yīng)用CRISPR系統(tǒng)的脫靶結(jié)合效應(yīng)具有重要意義。

圖3 CRISPR/dCas9的結(jié)合親和力受核酸熱力學(xué)控制

化工系張翀副教授和王天民博士（現(xiàn)為清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士后）為本文通訊作者，生物育種技術(shù)與裝備團(tuán)隊(duì)首席邢新會(huì)教授為本文共同作者。馮匯寶博士研究生、郭佳薈博士、王天民博士為本文的共同第一作者。該成果得到了國家自然科學(xué)基金委重點(diǎn)儀器研發(fā)項(xiàng)目、面上項(xiàng)目和博士后基金的資助。

論文鏈接：https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkaa1295/6121456